Shp2在口腔鳞癌中的表达及对其生物学行为的影响

【摘要】目的：头颈部鳞状细胞癌(Headandnecksquamouscellcarcinoma,HNSCC)主要影响口腔、舌咽、口咽、喉部及涎腺等,在常见的恶性肿瘤类型中位居第六,而口腔颌面部恶性肿瘤中约80%以上为口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)。尽管近几年我们在OSCC的治疗以及发病机制研究方面取得了一定的进展,但是在过去的几十年中其存活率仍没有明显改善,平均每年确诊的病例中仍有约50%的死亡率。蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(Srchomologyphosphotyrosylphosphatase2)由PTPN11基因编码,广泛地表达于机体各种组织和细胞中,其含有2个SH2结构区域,分别为N-SH2、C-SH2,及一个PTP结构区域,其作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子,参与细胞增殖、分化、迁移等诸多细胞重要的生命活动。研究表明,Shp2的编码基因PTPN11存在大量与人类疾病相关的遗传多态性与突变位点,作为重要的节点分子,Shp2在血液系统恶性肿瘤如白血病及实体肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌等的发生发展过程中发挥着重要的调控作用,是其肿瘤治疗的潜在分子靶点。目前国内外关于Shp2在口腔鳞癌中的表达及作用的研究鲜见报道。因此,本实验从临床标本、体外细胞和分子机制三个层面研究Shp2在口腔鳞癌中的表达及对其生物学行为的影响。首先通过临床病例标本检测口腔鳞癌组织及癌旁组织中Shp2的表达差异,并进一步分析其表达水平与患者的临床资料之间的关系,探讨Shp2在口腔鳞癌中的临床意义。其次,应用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术,构建Shp2慢病毒干扰载体,抑制舌鳞状细胞癌细胞SCC-4的Shp2基因表达,探讨Shp2基因沉默后对SCC-4细胞增殖、凋亡及侵袭能力的作用。同时研究Shp2基因沉默后对细胞凋亡相关蛋白的影响,初步阐明Shp2在口腔鳞癌细胞凋亡发生中的分子机制。本研究将为口腔鳞癌临床诊断、预后及治疗的新靶点提供新的思路和理论基础。方法：1.收集临床口腔鳞癌组织蜡块及临床有关资料,采用免疫组织化学染色方法观察Shp2蛋白在口腔鳞癌组织中的表达,并对免疫组化结果进行评分,评估Shp2的表达与患者的年龄、性别、烟酒暴露、肿瘤部位、肿瘤大小、临床分期、淋巴转移及病理分级等的相关性。2.收集18例临床手术中新鲜的口腔鳞癌及相应的癌旁正常组织,采用WesternBlot方法,进一步验证Shp2蛋白在口腔鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达差异。3.于Shp2PTPN11基因编码区选择4个siRNA靶点合成4对shRNA干扰序列,分别与慢病毒载体连接,构建Shp2基因RNA干扰慢病毒载体,筛选出最佳干扰组,显微镜下观察Shp2慢病毒干扰载体感染目的细胞人舌鳞状细胞癌细胞SCC-4的效率。应用RealTimePCR及Westernblot检测其干扰效率,筛选出最佳干扰组,建立稳定抑制Shp2基因表达的SCC-4细胞株,为探讨Shp2在口腔鳞癌发生中的作用提供细胞模型。4.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察Shp2基因沉默后对SCC-4细胞24h、48h、72h及96h增殖率的影响。5.应用流式细胞技术(AnnexinV-APC/7-ADD染色法)及WestenBlot方法研究Shp2基因沉默后对SCC-4细胞凋亡的影响及其凋亡相关蛋白p53、Bax及Bcl-2的变化。6.采用Transwell小室侵袭实验,通过苏木精染色和细胞计数观察Shp2基因沉默后对SCC-4细胞体外侵袭能力的影响。结果：1.免疫组化结果发现,在口腔正常黏膜组织中,Shp2表达阴性或者呈弱表达,而在口腔鳞癌临床样本中高表达；进一步临床资料统计分析表明,在口腔鳞癌中Shp2蛋白的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、饮酒无关,与肿瘤的发生部位和体积大小亦无关。然而,临床分期在III/IV期的肿瘤Shp2的表达较Ⅰ/Ⅱ期的强,在有淋巴转移的病例中,Shp2的表达显著增加,统计学上均有显著性差异(p<0.05)。2.临床新鲜口腔鳞癌组织进一步证明,除一例以外,Shp2在口腔鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中的表达(p<0.05),进一步验证了免疫组化结果。3.Real-timePCR和Westernblot检测结果显示Shp2-shRNA3干扰效率最佳,SCC-4细胞中Shp2基因及蛋白表达明显降低,应用RNAi设计的慢病毒干扰载体具有较好的干扰效果。4.MTT法测定发现,Shp2基因沉默后,96h内SCC-4细胞的生长明显慢于对照组,出现明显的增殖抑制。5.采用nnexin-V-APC/7-ADD双荧光标记,流式细胞仪检测细胞凋亡发现,转染Shp2慢病毒于扰载体72h后的SCC-4细胞中,细胞凋亡率明显增加,同对照组正常细胞相比,差异具有显著性(p<0.05)。WesternBlot结果显示,凋亡相关通路蛋白p53、Bax表达增加,Bcl-2表达下降。6.[ranswell小室侵袭实验结果显示,转染Shp2慢病毒干扰载体72h后的SCC-4细胞的侵袭能力与对照组相比较明显下降,差异具有显著性(p<0.05)。结论：Shp2在口腔鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,过表达的Shp2与口腔鳞癌的临床分期及淋巴转移密切相关；Shp2基因对口腔鳞癌细胞的生长起促进作用,同时可提高肿瘤细胞的侵袭能力；Shp2能抑制口腔鳞癌细胞凋亡,凋亡相关蛋白p53、Bax及bcl-2可能参与其凋亡调控机制。以上结果提示,Shp2与口腔鳞癌的进展和转移有关,在口腔鳞癌可能发挥重要的促癌基因作用,是口腔鳞癌淋巴结转移的危险因子,可作为口腔鳞癌临床诊断、判断预后、诊疗方案制定及肿瘤靶向治疗的潜在生物标记物和分子指标。
【作者】谢红军；
【导师】张东升；
【作者基本信息】山东大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2；口腔鳞状细胞癌；免疫组织化学；RNA干扰；生物学行为；

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